Loading...

Synthesis and Structural Activity Relationship (SAR) of Novel Pyridazine-based Inhibitors for Inhibition of Amyloid Fibril Formation, and Biosynthesis and Optimization of L-AsparaginaseII Enzyme for Hydrolysis of Non-Native Substrate

Nazari Khodadadi, Alireza | 2017

3139 Viewed
  1. Type of Document: M.Sc. Thesis
  2. Language: Farsi
  3. Document No: 50722 (03)
  4. University: Sharif University of Technology
  5. Department: Chemistry
  6. Advisor(s): Kalhor, Hamid Reza
  7. Abstract:
  8. After proteins, one of the important biological macromolecules, are synthesized by ribosomes,they automatically reach their own special 3-D structure. This native structur or better known as folded state is what determines the function of a protein. In some situations, the proteins become misfolded leading to its lack of biological function through aggregation or fibril formation known as "amyloid". The amyloid fibrils have been shown to be a causative factor in nerve decay such as Alzheimer's. Therefore, inhibition of amyloid formation using different approaches such as synthetic organic and natural compounds has, recently, been under spotlight. A pyridazine basedcompound (RS-0406) has been found to effectively inhibit amyloid formation, but no experimental evidence has been reported about its mechanism of inhibition. In the present work, 15 novel pyridazine-based compounds as analogues of RS-0406, were designed and synthesized. The results indicated that in addition to H-bonding, bulkiness, substituted position and solubility may have significant roles in amyloid inhibition. Moreover, by performing Quantitative Quantitative structure–activity relationship (QSAR) method, a carboxylic functional group was predicted to have a more effective inhibitory effect than the original lead compound. As L-asparaginase enzyme is the most important antileukemic drug; the enzyme by converting asparagine to aspartate mediates its anitlukemia function. In addition to the medicinal effect of this enzyme, its application as a biocatalyst has captured our attention. In this part of the thesis, the cloning and expression of L-asparginase were achieved and the enzyme will further be used to modify its active sites for novel organic reaction
  9. Keywords:
  10. Amyloid ; Cloning ; Pyridazine-Based Organic Compounds ; Quantitative Structure-Activity Relationship (QSAR)Model ; Asparaginase Enzyme ; Protein Misfolding ; Lysozyime

 Digital Object List

 Bookmark

  • چکیده
  • فهرست مطالب
  • فهرست شکل‌ها
  • فصل1 مقدمه
    • 1-1 اسیدهای نوکلئیک
      • 1-1-1 داکسی ریبونوکلئیک اسیدDNA
      • 1-1-2 ریبونوکلئیک اسیدRNA
    • 1-2 پروتئین‌ها
      • 1-2-1 ساختمان اول پروتئین
      • 1-2-2 ساختمان دوم پروتئین
      • 1-2-3 ساختمان سوم پروتئین
      • 1-2-4 ساختمان چهارم پروتئین
    • 1-3 تاخوردن پروتئین
    • 1-4 چاپرون
    • 1-5 غلط تا خوردن پروتئین و تشکیل تجمع‌های پروتئین
    • 1-6 فیبریل‌های آمیلوئیدی
    • 1-7 ساختار فیبریل‌های آمیلوئیدی
    • 1-8 حدواسط‌ها در فرآیند تشکیل فیبریل‌های آمیلوئیدی
    • 1-9 بیماری‌های مرتبط با غلط تاخوردگی پروتئین
    • 1-10 آلزایمر و پپتید Aβ
    • 1-11 لیزوزیم به عنوان مدل برای مطالعه آمیلوئید
    • 1-12 ناحیه آمیلوئیدوژنیک لیزوزیم
    • 1-13 روش‏های تشخیص فیبریل‌های آمیلوئیدی
      • 1-13-1 اتصال تایوفلاوین Thiofalvin-T (Th-T)
      • 1-13-2 الکتروفورز ژل آگارز
      • 1-13-3 عکس‌برداری میکروسکوپ‌ الکترونی عبوری
      • 1-13-4 طیف‌سنجی دو رنگ نمایی دورانی
    • 1-14 مهارکننده‌های تشکیل فیبریل‌های آمیلوئیدی
    • 1-15 پیریدازین
      • 1-15-1 خواص دارویی پیریدازین
    • 1-16 کمومتریکس و کاربرد آن در طراحی دارو
    • 1-17 ارتباط کمی ساختار و فعالیت(QSAR)
    • 1-18 رگرسیون
    • 1-19 روش‌های پارامتری
    • 1-20 کلون سازی ژن به‌منظور تولید پروتئین‌های نوترکیب
      • 1-20-1 وکتور و پلاسمید
      • 1-20-2 آنزیم‌های محدودالاثر
      • 1-20-3 تکثیر ژن در شرایط in vitro با استفاده از واکنش زنجیره‌ای پلیمراز
        • 1-20-3-1 مکانیسم پلیمره‌شدن در واکنش زنجیره‌ای پلیمراز
        • 1-20-3-2 پرایمر
      • 1-20-4 لیگاسیون
      • 1-20-5 بیان پروتئین
    • 1-21 آنزیم II L-asparaginase
      • 1-21-1 تاریخچه
      • 1-21-2 عملکرد بیولوژیکی
      • 1-21-3 مکانیسم هیدرولیز کردن اسیدآمینه اسپارژین
      • 1-21-4 سایت فعال آنزیم اسپاراژیناز
      • 1-21-5 انواع آنزیم اسپارژیناز
    • 1-22 بیواورگانیک
    • 1-23 مزایای استفاده از آنزیم‌ها در مقایسه با کاتالیست‌های معدنی
      • 1-23-1 استراتژی مهندسی پروتئین
    • 1-24 جهش و ترمیم DNA
      • 1-24-1 جهش نقطه‌ای
      • 1-24-2 جهش حذفی
      • 1-24-3 جهش تصادفی
    • 1-25 هدف از پژوهش حاضر
  • فصل2 مواد و روش پژوهش
    • 2-1 سنتز ترکیبات آلی سنتزشده بر پایه پیریدازین
      • 2-1-1 سنتز N3,N6 - دی (-3هیدروکسی فنیل)پیریدازین-3و6 دی آمین (Py-1)
      • 2-1-2 سنتز N3,N6 - دی (-4هیدروکسی فنیل)پیریدازین-3و6 دی آمین (Py-2)
      • 2-1-3 سنتز N3,N6 - دی (-3متوکسی فنیل)پیریدازین-3و6 دی آمین (Py-3)
      • 2-1-4 سنتز N3,N6 - دی فنیل پیریدازین-3و6 دی آمین (Py-4)
      • 2-1-5 سنتز N3,N6 - دی (-4برومو فنیل)پیریدازین-3و6 دی آمین (Py-5)
      • 2-1-6 سنتز N3,N6 - دی (-3,4دی کلرو فنیل)پیریدازین-3و6 دی آمین (Py-6)
      • 2-1-7 سنتز N3,N6 - دی (-3فلورو فنیل)پیریدازین-3و6 دی آمین (Py-7)
      • 2-1-8 سنتز N3,N6 - دی (-3نیترو فنیل)پیریدازین-3و6 دی آمین (Py-8)
      • 2-1-9 سنتز N3,N6 - دی (-3کلرو فنیل)پیریدازین-3و6 دی آمین (Py-9)
      • 2-1-10 سنتز N3,N6 - دی (-4کلرو فنیل)پیریدازین-3و6 دی آمین (Py-10)
      • 2-1-11 سنتز N3,N6 - دی (-4متیل بنزوات)پیریدازین-3و6 دی آمین (Py-11)
      • 2-1-12 سنتز N3,N6 - دی (-4نیترو فنیل)پیریدازین-3و6 دی آمین (Py-12)
      • 2-1-13 سنتز N3,N6 - دی (-4فلورو فنیل)پیریدازین-3و6 دی آمین (Py-13)
      • 2-1-14 سنتز N3, N6 - دی (-3متیل فنیل) پیریدازین-3و6 دی آمین (Py-14)
      • 2-1-15 سنتز N3,N6 - دی (4- بزوئیک اسید)پیریدازین-3و6 دی آمین (Py-15)
    • 2-2 بررسی فعالیت بیولوژیکی ترکیبات سنتز شده در جلوگیری از تشکیل فیبریل‌های آمیلوئیدی پروتئین لیزوزیم
      • 2-2-1 شرایط تشکیل فیبریل پروتئین لیزوزیم
      • 2-2-2 پیدا کردن حلال کمکی
      • 2-2-3 ساختن استوک بازدارنده (ترکیبات سنتزشده)
      • 2-2-4 تشکیل فیبریل پروتئین لیزوزیم در حضور ترکیبات سنتز شده به عنوان بازدارنده
      • 2-2-5 بررسی میزان جلوگیری از میزان تشکیل فیبریل با استفاده از آزمایش نشر تایوفلاوین
      • 2-2-6 آزمایش TEM
      • 2-2-7 آزمایش Far CD
      • 2-2-8 آزمایش ژل الکتروفورز
      • 2-2-9 غلظت مهار رشد 50درصد(IC50)
      • 2-2-10 ارتباط کمی ساختار و فعالیت(QSAR)
    • 2-3 کلون سازی و بیان پروتئین آسپاراژیناز
      • 2-3-1 انتخاب وکتور
      • 2-3-2 آماده‌سازی وکتور Pet26b + جهت کلونینگ
        • 2-3-2-1 رشد دادن سلول DH5 در محیط جامد
        • 2-3-2-2 رشد دادن سلول DH5 در محیط مایع
        • 2-3-2-3 استخراج پلاسمید
        • 2-3-2-4 ژل الکتروفورز آگارز به منظور بررسی پلاسمید استخراج‌شده(الکتروفورز افقی)
        • 2-3-2-5 هضم آنزیمی و خالص‌سازی وکتور
        • 2-3-2-6 ژل اکریل آمید برای DNA
        • 2-3-2-7 رنگ‌آمیزی به کمک نقره
      • 2-3-3 طراحی پرایمر
        • 2-3-3-1 نکاتی که هنگام طراحی پرایمر باید رعایت کرد
      • 2-3-4 آماده‌سازی ژن آنزیم اسپارژیناز جهت کلونینگ
        • 2-3-4-1 رشد دادن سلول باکتری E-coli UTI89
        • 2-3-4-2 استخراج ژن
        • 2-3-4-3 واکنش زنجیره‌ای پلیمراز
        • 2-3-4-4 چک کردن محصول به کمک ژل الکتروفورز افقی
        • 2-3-4-5 تخلیص کردن محصول PCR
        • 2-3-4-6 هضم آنزیمی بر روی محصول PCR
      • 2-3-5 لیگاسیون
      • 2-3-6 ساخت سلول‌های باکتری مستعد ترانسفرم کردن محصول لیگاسیون(وکتور نوترکیب) به درون باکتری DH5α
    • 2-4 بیان پروتئین نوترکیب در سیستم باکتری و استخراج پروتئین تولیدشده
    • 2-5 الکتروفورز پروتئین SDS-PAGE
      • 2-5-1 آماده‎‏سازی ژل و بارگذاری نمونه‏ها
      • 2-5-2 رنگ‌آمیزی ژل
      • 2-5-3 رنگ بری ژل
    • 2-6 وسترن بلات
  • فصل3 بحث و نتیجه‌گیری
    • 3-1 سنتز N3,N6 - دی (3-هیدروکسی فنیل) پیریدازین-3و6 دی آمین (Py-1)
      • 3-1-1 طیف 1HNMR ترکیب Py-1
      • 3-1-2 طیف 13CNMR ترکیب Py-1
      • 3-1-3 طیف HSQC ترکیب Py-1
    • 3-2 سنتز N3,N6 - دی (4-هیدروکسی فنیل)پیریدازین-3و6 دی آمین (Py-2)
      • 3-2-1 طیف 1HNMR ترکیب Py-2
      • 3-2-2 طیف جرمی
    • 3-3 سنتز N3,N6 - دی (3-متوکسی فنیل)پیریدازین-3و6 دی آمین (Py-3)
      • 3-3-1 طیف 1HNMR ترکیب Py-3
      • 3-3-2 طیف 13CNMR ترکیب Py-3
      • 3-3-3 طیف HSQC ترکیب Py-3
    • 3-4 سنتز N3,N6 - دی فنیل پیریدازین-3و6 دی آمین( (Py-4
      • 3-4-1 طیف 1HNMR ترکیب Py-4
      • 3-4-2 طیف 13CNMR ترکیب Py-4
      • 3-4-3 طیف HSQC ترکیب Py-4
    • 3-5 سنتز N3,N6 - دی (4-برومو فنیل)پیریدازین-3و6 دی آمین (Py-5)
      • 3-5-1 طیف 1HNMR ترکیب Py-5
      • 3-5-2 طیف 13CNMR ترکیب Py-5
    • 3-6 سنتز N3,N6 - دی (3,4-دی کلرو فنیل)پیریدازین-3و6 دی آمین (Py-6)
      • 3-6-1 طیف 1HNMR ترکیب Py-6
      • 3-6-2 طیف 13CNMR ترکیب Py-6
    • 3-7 سنتز N3,N6 - دی (3-فلورو فنیل)پیریدازین-3و6 دی آمین (Py-7)
      • 3-7-1 طیف 1HNMR ترکیب Py-7
      • 3-7-2 طیف 13CNMR ترکیب Py-7
    • 3-8 سنتز N3,N6 - دی (3-نیترو فنیل)پیریدازین-3و6 دی آمین (Py-8)
      • 3-8-1 طیف 1HNMRترکیب Py-8
      • 3-8-2 طیف 13CNMR ترکیب Py-8
    • 3-9 سنتز N3,N6 - دی (3-کلرو فنیل)پیریدازین-3و6 دی آمین (Py-9)
      • 3-9-1 طیف 1HNMR ترکیب Py-9
      • 3-9-2 طیف 13CNMR ترکیب Py-9
    • 3-10 سنتز N3,N6 - دی (4-کلرو فنیل)پیریدازین-3و6 دی آمین (Py-10)
      • 3-10-1 طیف 1HNMR ترکیب Py-10
      • 3-10-2 طیف 13CNMR ترکیب Py-10
    • 3-11 سنتز N3,N6 - دی (4-متیل بنزوات)پیریدازین-3و6 دی آمین (Py-11)
      • 3-11-1 طیف 1HNMR ترکیب Py-11
      • 3-11-2 طیف 13CNMR ترکیب Py-11
    • 3-12 سنتز N3,N6 - دی (4-نیترو فنیل)پیریدازین-3و6 دی آمین (Py-12)
      • 3-12-1 طیف 1HNMR ترکیب Py-12
      • 3-12-2 طیف 13CNMR ترکیب Py-12
    • 3-13 سنتز N3,N6 - دی (4-فلورو فنیل)پیریدازین-3و6 دی آمین (Py-13)
      • 3-13-1 طیف 1HNMR ترکیب Py-13
      • 3-13-2 طیف 13CNMR ترکیب Py-13
    • 3-14 سنتز N3, N6 - دی (3-متیل فنیل) پیریدازین-3و6 دی آمین (Py-14)
      • 3-14-1 طیف 1HNMR ترکیب Py-14
      • 3-14-2 طیف 13CNMR ترکیب Py-14
    • 3-15 سنتز N3,N6 - دی (4- بزوئیک اسید)پیریدازین-3و6 دی آمین (Py-15)
      • 3-15-1 طیف 1HNMR
      • 3-15-2 طیف 13CNMR ترکیب Py-15
      • 3-15-3 طیف IR ترکیب Py-15
    • 3-16 بررسی مکانیسم سنتز آمیندارشدن پیریدازین
    • 3-17 بررسی میزان بازدارندگی ترکیبات سنتز شده در تشکیل فیبریل‌های آمیلوئید
      • 3-17-1 آنالیز اتصال تایوفلاوین
    • 3-18 بررسی بیشتر تأثیر حجم و موقعیت استخلاف در میزان بازدارندگی
    • 3-19 بررسی و مقایسه ساختار ترکیب‌هایی که در موقعیت استخلاف باهم متفاوت‌اند
    • 3-20 تأثیر موقعیت گروه هیدروکسی در آزاد شدن هیدروژن رادیکالی در Py-1 و Py-2
    • 3-21 آنالیز TEM
    • 3-22 آنالیز Circular Dichrosim (Far CD)
    • 3-23 ژل الکتروفورز
    • 3-24 QSAR
    • 3-25 نتیجه‌گیری
    • 3-26 کلون سازی و بیان آنزیم اسپاراژیناز
      • 3-26-1 آماده‌سازی وکتور
      • 3-26-2 آماده‌سازی ژن
      • 3-26-3 بررسی کلونی‌های به‌دست‌آمده
    • 3-27 تعیین توالی وکتور نوترکیب
    • 3-28 بیان پروتئین اسپاراژیناز نوترکیب
    • 3-29 نتیجه‌گیری
...see more