Loading...

Design, Expression, and Evaluation of Nanoparticle Structure Containing Malaria Vaccine Candidate Antigen by Self-assembled Peptide Nanoparticles (SAPNs) and Confirmation of its Antigenicity Using Serum of Malaria Patients

Zahedi, Farhad | 2021

1083 Viewed
  1. Type of Document: M.Sc. Thesis
  2. Language: Farsi
  3. Document No: 54273 (06)
  4. University: Sharif University of Technology
  5. Department: Chemical and Petroleum Engineering
  6. Advisor(s): Alemzadeh, Iran; Abouei Mehrizi, Akram; Sardari, Soroush; Zakeri, Sedigheh
  7. Abstract:
  8. Malaria is one of the most important infectious diseases in the tropical and subtropical regions of the world and is caused in humans by the bite of the female Anopheles mosquito of five species of Plasmodium. According to the World Health Organization, about 229 million people worldwide were infected in 2019 by the disease, and 409,000 people died from the disease. Resistance of the parasite against drugs and resistance of vectors to insecticides and larvicides, which prevents the elimination and eradication of malaria, shows the need for new strategies, such as having an effective vaccine against this disease. In the second generation of vaccines, to develop malaria vaccines, recombinant proteins are used. Unfortunately, recombinant proteins are weak immunogens. One way to increase the immunogenicity of proteins is to convert the peptides to nanoparticles by aggregating them together to form nanoscale particles called self-assembled peptide nanoparticles (SAPNs). In this project, a SAPN based on two HAP2-GCS and cd loop domains of Plasmodium falciparum GCS1 antigen was designed and validated in silico by bioinformatics methods and molecular dynamics simulations. The synthetic gene was synthesized (according to the design), cloned, and expressed in the prokaryotic expression system. SAPN size was confirmed in nano dimensions by the DLS test. The shape of the SAPN was spherical with the approval of FESEM and TEM. SAPN antigenicity was approved using malaria patients' serum by Western blot and ELISA tests
  9. Keywords:
  10. Malaria Diease ; Molecular Dynamic Simulation ; Recombinant Protein ; Malaria Vaccines ; Self Assembled Peptide Nanoparticle (SAPN) ; Nanovaccine

 Digital Object List

 Bookmark

  • مقدمه
    • اهمیت موضوع
    • بیان مسئله
    • اهداف پژوهش
    • ساختار پایان‌نامه
  • مبانی نظری پژوهش
    • مالاریا
    • توزیع جهانی مالاریا
      • توزیع مالاریا در ایران
    • سیکل زندگی پلاسمودیوم
    • گونه‌های پلاسمودیوم عامل مالاریای انسانی
      • انواع گونه‌های پلاسمودیومی آلوده کننده‌ی انسانی و ویژگی‌های خاص هر گونه
      • ویژگی‌های مشترک گونه‌های پلاسمودیوم
    • علائم بالینی بیماری
    • پاسخ‌های سیستم ایمنی دربرابر پلاسمودیوم
      • فرار ایمنی
    • اقدامات برای کنترل، حذف و ریشه‌کنی مالاریا
      • چالش‌های موجود بر سر راه حذف مالاریا
      • تست‌های تشخیصی
        • چالش‌‌های سر راه تست‌های تشخیصی
      • پیش‌گیری، درمان و توقف انتقال مالاریا
        • چالش‌های پیش ‌رو برای پیش‌گیری درمان و توقف انتقال مالاریا
      • کنترل وکتور
        • چالش‌های سر راه کنترل وکتوری
      • واکسن
        • آنتی‌ژن GCS1
        • چالش‌های سر راه واکسن
    • انواع واکسن از نظر فناوری ساخت
      • واکسن‌های نسل اول
      • واکسن‌های زیرواحدی
        • واکسن‌های زیرواحدی برپایه‌ی آنتی‌ژن‌های ایمنوژن
        • نانوواکسن‌ها
          • نانوذره‌های پلی‌مری
          • نانوذره‌های غیرآلی
          • نانوذره‌های برپایه‌ی لیپید
          • نانوذره‌های شبه‌ویروسی
          • نانوذره‌های پپتیدی خودمونتاژ
        • معرفی نانوذره‌های پپتیدی خودمونتاژ
          • مفهوم خودمونتاژی
        • طبقه‌بندی نانوذره‌های پپتیدی خودمونتاژ
          • نانوذره‌های پپتیدی خودمونتاژ با صفحات
          • نانوذره‌های پپتیدی خودمونتاژ با ساختار کویلدکویل
        • کاربردهای نانوذره‌های پپتیدی خودمونتاژ در طراحی واکسن
        • مزایا و معایب واکسن‌های نانوذره‌های پپتیدی خودمونتاژ
  • مطالعات پیشین
  • مواد و روش‌ها
    • مواد و تجهیزات استفاده شده در پژوهش
    • روش‌ها
      • آنالیزهای بیوانفورماتیک به‌منظور طراحی واکسن SAPN
        • طراحی توالی الیگومری با قابلیت ایجاد کویلدکویل
        • ویژگی‌های فیزیکوشیمیایی توالی SAPN-PfGCS1
        • ساختار سه‌بعدی توالی آمینواسیدی
        • بررسی پایداری ساختار سه‌بعدی پیش‌بینی شده
          • شبیه‌سازی دینامیک مولکولی با گرومکس
          • شبیه‌سازی دینامیک مولکولی با نمدی
        • پیش‌بینی آنتی‌ژنیسیته و آلرژنیسیته الیگومر
        • مونتاژ الیگومرها
      • کلون و بیان ناحیه‌ی ژنی سازنده‌ی نانوذره‌ی پپتیدی خودمونتاژ دارای آنتی ژن هدف
        • سنتز ژن
        • ترانسفورماسیون DNA‌ی نوترکیب به سلول‌های شایسته‌ی E. coli DH5
        • کشت باکتری‌های E. coli DH5 ترانسفورم شده با پلاسمیدهای دارای ژن SAPN-PfGCS1
        • استخراج پلاسمید از سلول‌های ترانسفورم شده‌ی E. coli DH5
        • الکتروفورز پلاسمیدهای استخراج شده دارای ژن SAPN-PfGCS1بر روی ژل آگارز
        • هضم آنزیمی پلاسمیدهای دارای ژن SAPN-PfGCS1با آنزیم‌های محدود کننده و الکتروفورز آن‌ها
        • ترانسفورماسیون پلاسمیدهای دارای ژن SAPN-PfGCS1به سلول‌های بیانی E. coli BL21(DE3)
        • بیان ژن SAPN-PfGCS1در سلول‌های E. coli BL21(DE3) ترانسفورم شده با پلاسمیدهای دارای ژن SAPN-PfGCS1
        • الکتروفورز نمونه های بیانی بر روی SDS-PAGE
        • بهینه‌سازی میزان IPTG لازم برای القای بیان پروتئین
        • وسترن بلات از پروتئین SAPN-PfGCS1
        • تعیین غلظت مناسب اوره برای محلول‌های تخلیص و تخلیص پروتئین‌های بیان شده در سلول‌های بیانی E. coli BL21(DE3) حاوی پلاسمیدهای دارای ژن SAPN-PfGCS1
        • دیالیز پروتئین‌های SAPN-PfGCS1
        • پراکندگی نور دینامیکی
        • میکروسکوپ الکترونی روبشی گسیل میدانی
        • میکروسکوپ الکترونی عبوری
      • کلون و بیان ناحیه‌ی ژنی سازنده‌ی نانوذره‌ی پپتیدی خودمونتاژ فاقد آنتی ژن هدف
        • PCR ناحیه‌ی ژنی کدکننده‌ی پروتئین SAPN-NC(کنترل) و الکتروفورز محصولات
          • طراحی پرایمر
        • خالص‌سازی محصول PCR از روی ژل آگارز
        • اتصال DNA تخلیص شده به ناقل pGEM T-easy
        • انتقال محصولات لیگاسیون به سلول‌های E. coli DH5
        • استخراج پلاسمید و هضم آنزیمی جهت تعیین کلون‌های حاوی پلاسمیدهای دارای SAPN-NC
        • همسانه‌سازی ژن SAPN-NCدر پلاسمید pQE-30 و ترانسفورم آن به E. coli M15
        • غربالگری و شناسایی پلاسمیدهای نوترکیب حاصل از همسانه‌سازی به روش کلونی PCR
        • استخراج پلاسمید نمونه‌های مثبت حاصل از کلونی PCR و هضم آنزیمی آن‌ها
        • بیان سلول‌های بیانی E. coli M15 ترانسفورم شده با پلاسمید pQE-30 دارای ژن SAPN-NC
        • تخلیص و دیالیز پروتئین‌های بیان شده در سلول‌های بیانی E. coli M15 ترانسفورم شده با پلاسمید pQE-30 دارای ژن SAPN-NC
        • آزمون الایزای نمونه‌های دیالیز شده
  • نتایج و تجزیه‌وتحلیل یافته‌ها
    • بیوانفورماتیک
      • توالی الیگومری با قابلیت ایجاد کویلدکویل
      • تایید وجود قطعات با ویژگی کویلدکویلی در توالی
      • تعداد هومومر برای هر ناحیه‌ی کویلدکویلی
      • ویژگی‌های فیزیکوشیمیایی برای توالی SAPN-PfGCS1
      • ساختار سه‌بعدی توالی SAPN-PfGCS1
      • ویژگی‌های آنتی‌ژنیسیته و آلرژنیسیته توالی SAPN-PfGCS1
      • آزمون شبیه‌سازی دینامیک مولکولی
        • شبیه‌سازی دینامیک مولکولی با نمدی
        • شبیه‌سازی دینامیک مولکولی با گرومکس
      • مونتاژ
    • آزمون‌های تجربی
      • الکتروفورز پلاسمیدهای pET-24a(+) حاوی ژن SAPN-PfGCS1
      • الکتروفورز برش آنزیمی پلاسمیدهای pET-24a(+) حاوی ژن SAPN-PfGCS1
      • تایید بیان SAPN-PfGCS1در سلول بیانی E. coli BL21(DE3)
      • تایید بیان SAPN-PfGCS1با استفاده از anti-His antibody و سرم موشی
      • میزان بهینه‌ی IPTG برای بیان در سلول های بیانی
      • تعیین غلظت اوره برای محلول‌سازی پروتئین در زمان تخلیص
      • تخلیص پروتئین SAPN-PfGCS1
      • دیالیز پروتئين‌های SAPN-PfGCS1
      • پراکندگی نور دینامیکی
      • میکروسکوپ FESEM
      • میکروسکوپ TEM
      • کلونینگ ژن SAPN-NCدر ناقل کلونینگ pGEM T-easy
      • وکتورهای pGEM T-easy (شرکت پرومگا)
      • ساب‌کلونینگ ژن کدکننده‌ی SAPN-NCدر پلاسمید بیانی pQE-30
      • بیان و تخلیص SAPN-NCدر میزبان E. coli M15 حاوی پلاسمید نوترکیب SAPN-NCpQE-30-
      • تایید بیان SAPN-NCبا استفاده از anti-His antibody
      • دیالیز پروتئین‌های SAPN-NC
      • شناسایی SAPN حاوی بخش‌هایی از آنتی‌ژن PfGCS1 توسط سرم بیماران آلوده به پلاسمودیوم فالسیپاروم
      • مقایسه‌ی نتایج حاصل از پژوهش پیش رو با مطالعات پیشین
  • نتیجه‌گیری و پیشنهادها
    • نتیجه‌گیری
    • محدودیت‌های پژوهش
    • پیشنهادها
...see more